Como en otras cinasas, el oxígeno del fosfato β del ADP realiza un ataque nucleofílico sobre el fósforo del PEP facilitado por Mg+2 y por grupos de la enzima. El sitio activo es hidrofóbico y el agua queda excluida evitando la hidrólisis.
Cuando el fosfato pasa al ATP, el enolato se isomeriza a su forma más estable, la forma ceto y la tautomería está desplazada hacia la cetona.
Resulta termodinámicamente muy desfavorable el rehacer el enolato para volver a fosforilarlo.
El secreto está en el equilibrio CETO <=> ENOL