∆Gº'=﹣6.3 kcal/mol
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La formación del polímero procede por substitución nucleofílica tipo SN2 que ocurre cuando el alcohol de la posición 3' de un nucleótido ataca al enlace anhídrido entre el fosfato α y el fosfato β de un nucleótido 5' trifosfatado, para desplazar a un pirofosfato.
El enlace resultante en un doble ester de fosfato, llamado enlace fosfodiester en el que el grupo fosfato está esterificado al alcohol 3' del nucleótido precedente y al alcohol 5' del grupo subsecuente.
El grupo 3'OH del nucleótido recién añadido queda disponible para unir un nuevo dNTP a ese extremo, por lo que decimos, que la cadena crece en la dirección: 5'→3'.
La reacción es termodinámicamente favorable y lo será más, si el pirofosfato es hidrolizado a fosfato inorgánico, como ocurre en la célula.