Para catalizar su reacción la HK usa Mg2+. Casi todas las cinasas lo requieren.
Mediante catálisis ACIDO-BASE general, la enzima remueve el protón del alcohol de la posición 6 y lo vuelve un nucleófilo reactivo.
Este alcóxido ataca al fósforo deficiente en electrones y desplaza al fosfato-γ del ATP en una reacción SN2
La posición de la base asegura que sea el alcohol de la posición 6 el que ataca, haciendo a la enzima regioselectiva.
Varios puentes de hidrógeno azúcar-proteína hacen que la α-D-glucosa se una mejor que otras hexósas, o sea, la enzima tiene enantioslectividad.