En cualquiera de los tres casos anteriores, si la concentración de un sustrato se mantiene constante, las variaciones en la velocidad debidas a la variación del segundo sustrato siguen una cinética de Michaelis y Menten.
Sin embargo, sólo a nivel saturante del sustrato no variado, los valores KM y VMAX obtenidos reflejan valores reales.
En otros casos son APARENTES
i) si [B] es saturante: KMA y VMAX
ii) si [A] es saturante: KMB y VMAX
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0
1
2
3
4
5
6
[A]
(sustrato variable)
(ML
-3
)
velocidad (ML
-3
T
-1
)
[B]
CRECIENTE
Reacciones con dos sustratos II. Isotermas de saturación
Es este experimento teórico, la enzima sigue un mecanismo secuencial ordenado.
El sustrato A se añade a concentración creciente, mientras el sustrato B permanece a una concentración fija. Al sustrato A lo consideramos “variable”.
El experimento se repite tres veces más, con el sustrato B a una concentración cada vez mayor. El sustrato B es pues “fijo-variable”.
En la curva más alta, para fines prácticos, la concentración del sustrato [B] alcanza un nivel saturante pues la diferencia [E]T – [E·S] es inferior a la incertidumbre experimental, es decir, la concentración de enzima libre nos daría cero, dentro del margen de incertidumbre experimental.
Así, en esa condición, el E·A formado pasaría cuantitativamente a E·AB y al alcanzar [A] un valor saturante, ambos sustratos lo serían, de modo que [E·AB] ≈ [E]T, siendo la actividad v0 ≈ kCAT [E]T.
Si comparamos ahora los pasos con el esquema que usamos para deducir la ecuación de MM, vemos que la situación es análoga. Solo que ahora la KM representa la afinidad por A (KMA) y kCAT/KMA es la constante de especificidad para A.
En cualquiera de las curvas inferiores los valores de los parámetros calculados son valores aparentes que no reflejan el comportamiento puro de la enzima, sino que están afectados por factores que dependen del valor de [B] empleado.