La enzima tiene un mecanismo interesante.
Un residuo de lisina se modifica con el ATP, pero se queda unido al AMP y dela salir al pirofosfato.
Esta enzima modificada pega el AMP al fosfato del lado 5' de los fragmentos a unir y forma un extremo exótico 5' - 5' pirofosfato
A5'-P-O-P-5'-DNA
Este extremos es un sitio activado que puede ser unido al 3'OH vecino por ataque nucleofílico al anhídrido difosfato.