Al igual que las DNA polimerasas, las RNA polimerasas usan Mg2+ para catalizar la reacción y promueve el ataque nucleofílico del 3'OH al fósforo α desplazando pirofosfato. Por tanto, la síntesis siempre avanza de 5' a 3'.
Para que la reacción se dé, la plantilla y el nucleótido entrante tienen que estar bien apareados, pero a diferencia de las DNA polimerasas, el cebador puede ser un solo nucleótido y puede estar trifosfatado.
En la replicación, una RNA polimerasa especial produce cebadores de RNA para la DNA polimerasa y recibe el DNA primasa.