La síntesis siempre ocurre en la dirección 5’ → 3’
En el sitio activo de la enzima hay dos átomos de Mg2+. El metal es esencial para polarizar y unir los fosfatos y es así, como aumenta la electrofilicidad del fósforo, que de suyo es deficiente en electrones.
El mecanismo es por ataque nucleofílico del alcohol 3' al enlace anhídrido entre el fosfato α y β del NTP, desplazando al pirofosfato.
Una base de la enzima desprotona al alcohol 3' y promueve el ataque nuclefílico, pero solo si el apareamiento del nucleótido trifosfatado con la plantilla es el "NATURAL".
Además, la enzima require que la base de la hebra naciente en el lado 3'OH, al que se unirá el nucleótido, también esté bien apareado.
Por esta razón, las DNA polimerasas solo puede iniciar la síntesis si hay un pequeño fragmento, ya unido, que sea complementario, es decír, requieren un cebador.