La cromatografía en fase reversa (RPC) permite separar moléculas en base a su polaridad. El principio de la cromatografía en fase reversa es semejante al de la cromatografía en capa fina. Sin embargo, aquí la fase estacionaria es de patículas de sílica químicamente modificadas con hidrocarburos saturados, insaturados o aromáticos de diferentes tipos. Esto convierte a la fase estacionaria en una matríz apolar. Por lo tanto, para este tipo de cromatografías se emplean mezclas de solventes polares, tales como agua, acetonitrilo, acetato de etilo, acetona y alcoles alifáticos.
En virtud de lo anterior, este tipo de cromatografía ha sido también llamada como cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). En general, este último término se ha empleado para referirse a las aplicaciones en las que se emplean substituyentes y matrices compatibles con fluidos biológicos. Por tanto, el termino HIC es común cuando se habla de purificación de proteínas y carbohidratos, en tanto que RPC es más empleado para referirse a la separación de moléculas en sistemas que son inadecuados para la separación de macromoléculas biológicas.
Las moléculas se retienen en la columna en virtud de las interacciones hidrofóbicas que establecen con la sílica modificada. Aunque, las interacciones hidrofóbicas son en general bastante débiles, son también a menudo muy numerosas y para eluír las moléculas es casi siempre necesario disminuir la polaridad del disolvente; para ello se puede substituir el agua de la fase móvil con un solvente orgánico cuya concentración se va aumentando gradualmente.
Debido a diversas limitaciones prácticas de la cromatografía de capa fina en fase reversa, entre las que destaca el costo de usar placas no reutilizables de una matríz difícil de sintetizar, la cromatografía en fase reversa ha sido adaptada para el uso de columnas. La versatilidad y eficiencia de este tipo de cromatografía se ha visto incrementada con el uso de sistemas de alto desempeño (HPLC, del inglés "High Performance Liquid Chromatography") que utilizan alta presión para mejorar la resolución y reducir los tiempos de separación.
Los sistemas de alto desempeño pueden también emplearse en otros tipos de cromatografías, de manera que para referirse a la cromatografía en fase reversa en sistemas de alto desempeño se emplea la abreviatura HPLC-RPC. También
Separación e identificación de Péptidos y aminoácidos.
En la separación de aminoácidos y péptidos mediante fase reversa la resina más comúnmente empleada posee una cadena lineal de 18 carbonos y se denomina como C18.
|SiO2|-(CH2)17-CH3
Dado que la resolución de los aminoáciodos mediente RPC requiere de sistemas de HPLC, es frecuente referirse al sistema como C18-HPLC.
La muestra se aplica a la columna en solución acuosa acidificada con ácido trifluoroacético, un ácido orgánico volátil y que se requiere muy puro. Para mejorar la solubilidad de los péptidos formados por aminoácidos muy apolares se añade al solvente un 10 a 20% de acetonitrilo. Aunque se han reportado otros sistemas de solventes, este último sigue siende en más empleado a pesar de la toxicidad del acetonitrilo.
A fin de eluír de la columna los aminoácidos más apolares es necesario aumentar la concentración de acetonitrilo en el sistema . Esto se hace en forma gradual durante la elución, lo cual permite una gran resolución en la separación de las moléculas.
El sistema C18-HPLC completo requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una bomba que inyectan líquido a la columna. Generalmente las columnas de sílica requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado, la mzcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y el inyector permite la aplicación de la muestra.
A la salida de la columna se coloca un detector (generalmente de absorción ultravioleta o de fluorescencia) y si se desea recuperar las moleculas que eluyen de la columna, se requiere un colector. En el análisis y la cuantificación de aminoácidos, la recuperación de la muestra es innecesaria; pero cuando se separan péptidos producto de la fragmentación de una proteína para propósitos de secuenciación, el colector es indispensable.
En los sitemas modernos la formación del gradiente de acetonitrilo y el analisis de la información obtenida se realizan mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la cromatografía, identificar la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su contenido.
Un cromatograma típico luce como sigue:
Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con estándares, que permiten identificar los aminoácidos presenter en la mezcla. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la curva del pico correspondiente.